После окончания учебы в ЛКИ в 1974 году Патрушев поступил на годичные курсы повышения квалификации Высшей школы КГБ СССР по специальности «правовед», а также окончил Высшие курсы КГБ при СМ СССР. После этого работал в контрразведке УКГБ СССР по Ленинградской области, где сделал карьеру от младшего оперуполномоченного до начальника службы по борьбе с контрабандой и коррупцией управления КГБ по Ленинградской области. Все это время вплоть до 1989 года начальником Патрушева был Олег Калугин, в настоящее время заочно осужденный за госизмену. В 1990 году Николая Патрушева перевели из Ленинграда в Карелию, предположительно, из-за конфронтации его патрона Калугина с партийным руководством. В том же году бывшие одноклассники Патрушева — Иванов и Грызлов, а также его подчиненный по УКГБ Карелии учредили МП «Блок». В июне 1992 года Патрушев стал министром безопасности Карелии, занимал эту должность до 1994 года. В 1993 году Грызлов и Елена Патрушева (супруга Николая Патрушева) учредили ТОО «Борг». В 1994 году Патрушев был переведен в Москву, где в течение четырех лет занимал должности начальника Управления собственной безопасности ФСК, заместителя руководителя департамента — начальника организационно-инспекторского управления Департамента по организационно-кадровой работе ФСБ. В книге Александра Литвиненко «ФСБ взрывает Россию» автор связывает перевод Патрушева в Москву с «делом о контрабанде карельской березы». По информации Литвиненко, Патрушев проходил свидетелем по возбужденному прокуратурой Петрозаводска делу по факту хищения и контрабанды дорогостоящей карельской березы. В ходе следствия, предположительно, было доказано соучастие Патрушева в преступлении. С 31 мая 1998 года был начальником Главного контролирующего управления Администрации Президента РФ, с 11 августа по 6 октября — заместителем руководителя Администрации президента. Сменил на должности начальника ГКУ Владимира Путина, ставшего первым замом руководителя АП. С 6 октября 1998 по 1999 год — заместитель директора ФСБ России, начальник Департамента экономической безопасности. С 16 апреля 1999 года — первый заместитель директора ФСБ, с 9 августа — и. о. директора ФСБ. С 16 августа 1999 года по 12 мая 2008 года занимал пост директора ФСБ России. С февраля 2006 по май 2008 года Патрушев возглавлял Национальный антитеррористический комитет России. С января 2001 по август 2003 года руководил Оперативным штабом по управлению контртеррористическими операциями на территории Северо-Кавказского региона. 12 мая 2008 года был назначен Секретарем Совета безопасности РФ. В 2018 году переназначен Владимиром Путиным на эту должность. В том же году был включен в санкционный «Кремлевский список» США. Доктор юридических наук. Награжден Почетной грамотой Правительства РФ (2001). Лауреат государственной премии РФ имени маршала Г. К. Жукова 2009 года за разработку в составе коллектива учебного пособия «Основы специальной подготовки сотрудников органов федеральной службы безопасности, командируемых в зону проведения контртеррористических операций на территории Северного Кавказа». Имеет множество государственных наград и дворянский титул.